ELISA標(biāo)準(zhǔn)操作及假陽性產(chǎn)生的原因分析

.本底及假陽性產(chǎn)生的原因分析

1. 基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別

1.1 基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或

酵母菌為表達(dá)系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)：

a． 分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達(dá)到

數(shù)百個(gè)氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。

b． 穩(wěn)定性好。包被的抗原的穩(wěn)定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被

抗原的試劑盒效期只有 3-4 個(gè)月，采用基因工程抗原后效期大大延長了。

c． 基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物包含更多的抗原決定

簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。

d． 純化難度大?；蚬こ炭乖募兓夹g(shù)難度較大。

1.2 合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片

段。合成肽抗原有以下特點(diǎn)：

a． 分子量太小

b． 一般只含有一個(gè)抗原決定簇

c． 純度高

d． 穩(wěn)定性差

由于基因工程抗原較于合成肽抗原有無可比擬的*性，ELISA 診斷試劑經(jīng)歷了從合

成肽向基因工程抗原的過渡。就 HCV ELISA 試劑盒來講，第一代產(chǎn)品為合成肽抗原，主要

是 HCV 特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，

只是當(dāng)時(shí)的基因工程抗原不全，僅包括了 HCV 的核心區(qū)片段；第三代產(chǎn)品基本上采用了基

因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的 HCV 特異性抗原。第三代試劑

的敏感度大大提高了。

由于歷史的原因，人們往往以反應(yīng)本底的好壞來衡量 ELISA 反應(yīng)試劑盒，因此有些廠

家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學(xué)敏

感度不夠，穩(wěn)定性也成問題。值得欣慰的是也有廠家堅(jiān)持試劑盒高的流行病學(xué)敏感度，科學(xué)

得對(duì)待反應(yīng)結(jié)果。

2．假陽性本底產(chǎn)生的原因

2. 1 抗原因素

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2.1. 1 融合蛋白對(duì)基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷試劑盒為例為例，因?yàn)榘坏幕?/p>

因工程抗原為融合蛋白，包含了來自表達(dá)載體的一些序列，因此可以與血清中抗大腸桿

菌的因子發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生了可疑標(biāo)本。

2.1.2 錯(cuò)誤排序的影響。合成肽在制備過程中，如果某些肽序列錯(cuò)誤，會(huì)導(dǎo)致合成肽特異性

改變而產(chǎn)生假陽性。另外，在構(gòu)建基因工程表達(dá)載體時(shí)引入的 HCV 核苷酸發(fā)生相位改變或

點(diǎn)突變也會(huì)對(duì)抗原的特異性產(chǎn)生不利的影響，但由于基因工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，由工藝原因

造成的抗原特異性降低會(huì)逐漸被克服。

2.2. 3 抗原純度對(duì)特異性的影響。以 HCV 抗原為例，利用大腸桿菌大規(guī)模表達(dá)后需經(jīng)破碎

細(xì)胞、鹽析、粒子交換柱等分離純化步驟才能后的到一定純度的 HCV 抗原。目前的

工藝還不能做到抗原純度為 100％，因此抗原中還混有大腸桿菌的其它雜蛋白，受過大

腸桿菌感染的人，血清中的抗大腸桿菌抗體可和這些雜蛋白產(chǎn)生反應(yīng)而引起假陽性。

2.2 人血清中的正常 IgG 

 人血清中 IgG 的濃度對(duì) HCV 試劑盒有較大的影響。HCV 試劑盒采用的間接法，酶標(biāo)抗

抗體能與人所有 IgG 結(jié)合，而 IgG 吸附于板孔的能力很強(qiáng)，因此我們采用 100 微升樣稀加

10 微升血清來將其稀釋以降低本底。到成人時(shí)，據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)調(diào)查，成人的 IgG 為 12mg/ml，

而有些人的 IgG 濃度會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于此，這部分人的血清經(jīng) ELISA 反應(yīng)后往往會(huì)顯色。

2.3 人血情中異常的 IgG 

結(jié)締組織病（系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性骨髓瘤等）等病癥時(shí)，血清中的風(fēng)濕小體和其它

異常 IgG（IgG 濃度達(dá)到 50mg/ml）會(huì)引起本底升高或假陽性。

2.4 溶血的影響

 當(dāng)溶血時(shí)，紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放到血清中，血紅蛋白具有過氧化物酶的性質(zhì)，當(dāng)其通

過吸附或“PP 效應(yīng)"（蛋白質(zhì)間相互吸附的現(xiàn)象）結(jié)合后，可催化 A、B 液顯色而造成假陽

性。

2.5 操作不當(dāng)引起

 任何操作不當(dāng)都會(huì)影響結(jié)果，因此在操作過程中保證操作的規(guī)范，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行是

得到準(zhǔn)確結(jié)果的關(guān)鍵核基礎(chǔ)。

2.5.1 加樣

2.5.1.1 樣品稀釋液少加，或血清多加，都會(huì)引起本底增高。對(duì)于間接法來說，受上述兩個(gè)

因素影響更大。因?yàn)檠逯惺軝z的特異性 IgG 只占總 IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很強(qiáng)，

非特異 IgG 可直接吸附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異的 IgG

均可以和酶標(biāo)二抗發(fā)生反應(yīng)而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多，高于規(guī)定

的稀釋倍數(shù)，必將帶來陰性高值。

2.5.1.2 酶結(jié)合物的不正確加入。一般來講，酶也有一定的非特異吸附，將包被好的酶聯(lián)板

再封閉，一方面也可避免酶的非特異性吸附。通常每孔加入的封閉液為 120μl。如果加入的

酶多于 120μl 或加在較高的孔壁上或孔口，也會(huì)引起本底升高或假陽性。

2.5.2 溫育

5.2.1 由于試劑盒確定的一定溫度下的反應(yīng)時(shí)間并不是反應(yīng)的終點(diǎn)，升高反應(yīng)的溫度，會(huì)

加快反應(yīng)，同樣增加時(shí)間會(huì)延長反應(yīng)，這樣得到的反應(yīng)程度會(huì)比試劑盒確定的反應(yīng)程度多，

也會(huì)引起陰性高值或假陽性。

5.2.2 由于試劑盒通常設(shè)定的反應(yīng)溫度為 37 度，在這個(gè)溫度下放置 30 分鐘，蒸發(fā)的水分

會(huì)很多，對(duì)于整個(gè)反應(yīng)體系來講，各種反應(yīng)物的濃度會(huì)不斷增加，這樣必會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)后的

值升高。因此溫育時(shí)應(yīng)蓋上膠貼。

5.2.3 試劑盒在設(shè)計(jì)時(shí)，反應(yīng)是在靜置條件下完成的，如果反應(yīng)改變?yōu)檎駝?dòng)條件，會(huì)加快

分子的熱運(yùn)動(dòng)，增加反應(yīng)的機(jī)會(huì)。

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5.2.4 試劑盒的溫育過程是在培養(yǎng)箱中進(jìn)行，這和水浴的條件不一樣。水浴可是酶聯(lián)板迅

速升溫，但較難將溫度控制在較穩(wěn)定的溫度，往往高于 37 度，同樣會(huì)引起高值陰性。

2.5.3.洗板

2.5.3.1 各個(gè)廠家使用的洗液配方是不同的，是根據(jù)各自試劑的條件配制的，采用不配套的

洗液常會(huì)得到不正常的反應(yīng)結(jié)果，包括本底過高。本公司的洗液采用獨(dú)特的洗滌系統(tǒng)不能和

其它公司的試劑盒混用。

2.5.3.2 試劑盒中提供的洗液是濃縮的，應(yīng)該稀釋到規(guī)定的倍數(shù)使用，過多稀釋洗液，會(huì)影

響洗液的效果，而使反應(yīng)的本底過高。

2.5.3.3稀釋洗液的水應(yīng)該是新鮮的蒸餾水，電導(dǎo)率小于1.2μs。如果水中含有過多的Ca2+、

Mg2+，這些離子會(huì)占用表面活性劑，影響洗滌效果。

2.5.3.4 洗板時(shí)，應(yīng)每孔加滿洗液，如果加入的洗液液量不夠，對(duì)洗滌的效果影響也是很大

的。本公司的酶聯(lián)板板孔為 400μl，比別的廠家的板孔大，因此洗了別公司的板后要及時(shí)

調(diào)整液量，以避免加液量不滿。

2.5.3.5 洗板的次數(shù)不夠孔內(nèi)多余的抗原（抗體）或酶結(jié)合物不能*去除，也會(huì)因此本底

升高。

2.5.3.6 洗板的強(qiáng)度和洗板的浸泡時(shí)間是密切相關(guān)的。洗板機(jī)不同，使用的泵不同，液體加

入時(shí)的沖力不同。如果加入洗液的沖力不大，也沒有設(shè)定浸泡時(shí)間，同樣會(huì)使結(jié)果的 A 值

偏高。

2.5.3.7 洗板完畢后，要進(jìn)行拍板，盡量采用質(zhì)量好的毛巾和吸水紙，使用易掉渣的紙，

紙屑會(huì)留在板孔中，由于紙屑中含有氧化劑而造成高值陰性。

2.5.4 顯色。加 A、B 液準(zhǔn)確，順序不能顛倒，要及時(shí)終止顯色。終止后要在 3 分鐘內(nèi)讀

數(shù)，否則強(qiáng)陽性會(huì)變低。

2.5.5.槍頭、加樣槽或其它來源的污染

如果使用的槍頭、加樣槽是反復(fù)使用的，必須肯定其沒有來自酶或陽性的污染。酶作為反應(yīng)

的催化劑，及其微量也會(huì)很明顯影響反應(yīng)。反復(fù)使用的槍頭、加樣槽清洗不當(dāng)，也會(huì)干擾反

應(yīng)。如將槍頭使用 84 消毒液浸泡而沒有沖洗干凈，因?yàn)?84 是強(qiáng)氧化劑，加入 AB 液后就會(huì)

顯色。同樣槍頭和加樣槽不正確清洗，改變加入試劑的 PH 值，反應(yīng)的結(jié)果也會(huì)不正常。常

常有人用手紙將加樣槽擦干，但是如果使用的手紙容易掉渣，會(huì)將紙上的強(qiáng)氧化劑留在槽中

而影響反應(yīng)。

2.5.6.測(cè) A 值時(shí)，微孔條底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面都可能引起 A 值的

升高。