單克隆抗體的制備全過程

原理：

B淋巴細胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力。B細胞的這種能力和量是有限的，不可能持續分化增殖下去，因此產生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細胞與非分泌型的骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，再進一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細胞是既具有瘤的無限生長的能力，又具有產生特異性抗體的B淋巴細胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細胞進行培養或注入小鼠體內即可獲得大量的高效價、單一的特異性抗體。這種技術即稱為單克隆抗體技術。

過程

1）免疫脾細胞的制備 制備單克隆抗體的動物多采用純系 Balb/c小鼠。免疫的方法取決于所用抗原的性質。免疫方法同一般血清的制備，也可采用脾內直接免疫法。
2）骨髓瘤細胞的培養與篩選 在融合前，骨髓瘤細胞應經過含8-AG的培養基篩選，防止細胞發生突變恢復HGPRT的活性（恢復HGPRT的活性的細胞不能在含8-AG的培養基中存活）。骨髓瘤細胞用10%小牛血清的培養液在細胞培養瓶中培養，融合前24h換液一次，使骨髓瘤細胞處于對數生長期。
3）細胞融合的關鍵:
1技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如，供者淋巴細胞沒有查到免疫應答。這必然要失敗的。
2融合試驗較大的失敗原因是污染，融合成功的關鍵是提供一個干凈的環境，以及適宜的無菌操作技術。

4）陽性克隆的篩選 應盡早進行。通常在融合后10天作第一次檢測，過早容易出現假陽性。檢測方法應靈敏、準確、而且簡便快速。具體應用的方法應根據抗原的性質，以及所需單克隆抗體的功能進行選擇。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法簡便，RIA法準確。陽性克隆的篩選應進行多次，均陽性時才確定為陽性克隆進行擴增。
5）克隆化 克隆化的目的是為了獲得單一細胞系的群體。克隆化應盡早進行并反復篩選。這是因為初期的雜交瘤細胞是不穩定的，有丟失染色體的傾向。反復克隆化后可獲得穩定的雜交瘤細胞株。克隆化的方法很多，而常用的是有限稀釋法。

（1）顯微操作法：在顯微鏡下取單細胞，然后進行單細胞培養。這種方法操作復雜，效率低，故不常用。
（2）有限稀釋法：將對數生長期的雜交瘤細胞用培養液作一定的稀釋后，按每孔1個細胞接種在培養皿中，細胞增值后成為單克隆細胞系。第一次克隆化時加一定量的飼養細胞。由于第一次克隆化生長的細胞不能保證單克隆化，所以為獲得穩定的單克隆細胞株需經2～3次的再克隆才成。應該注意的是，每次克隆化過程中所有有意義的細胞都應冷凍保存，以便重復檢查，避免丟失有意義的細胞。
（3）軟瓊脂法：將雜交瘤細胞稀釋到一定密度，然后與瓊脂混懸。在瓊脂中的細胞不能自由移動，彼此互不相混，從而達到單細胞培養的目的。但此法不如有限稀釋法好。
（4）熒光激光細胞分類法：用抗原包被的熒光乳膠微球標記雜交瘤細胞，然后根據抗原與雜交瘤細胞結合的特異性選出細胞，并進行單細胞培養。

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（5）細胞的凍存與復蘇
（6）大規模單克隆抗體的制備 選出的陽性細胞株應及早進行抗體制備，因為融合細胞隨培養時間延長，發生污染、染包體丟失和細胞死亡的機率增加。抗體制備有兩種方法。一是增量培養法，即將雜交瘤細胞在體外培養，在培養液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設備，一般應用無血清培養基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達數毫克甚至數十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。

單克隆抗體的制備全過程