Western Blot技術(shù)服務(wù)，WB免疫印跡，WB實(shí)驗(yàn)代測
免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting），它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。
凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA 結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)zui初用于研究DNA 結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。

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Western Blot實(shí)驗(yàn)
Western Blot技術(shù)服務(wù)，WB免疫印跡，WB實(shí)驗(yàn)代測

成功完成Western Blot檢測，必須滿足4個條件：

凝膠洗脫：轉(zhuǎn)移期間蛋白質(zhì)必須從凝膠中洗脫出來，如果蛋白質(zhì)還截留在凝膠中，將無法在膜上進(jìn)行分析

吸附到膜上：在轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無法在膜上進(jìn)行分析

處理期間仍截留在膜上：在轉(zhuǎn)移后的處理過程中蛋白質(zhì)必須保持吸附在印跡膜上

處理過程中可接近：被吸附的蛋白質(zhì)必須能夠與檢測試劑接觸，如果蛋白質(zhì)被掩蓋則無法檢測

成功進(jìn)行WB檢測，則設(shè)置合適正確的對照是*的，只要正確設(shè)置了這些對照，即可快速和準(zhǔn)確的找到WB的問題所在，并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性！一般需要設(shè)置的對照如下：

陽性對照：明確表達(dá)檢測蛋白的組織或細(xì)胞，用于檢測抗體的工作效率

陰性對照：明確不表達(dá)檢測蛋白組織或細(xì)胞，用于檢測抗體的特異性

二抗對照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性

內(nèi)參對照：檢測標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)

空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質(zhì)和封閉的效果 

WB 檢測基本過程 

1 、獲取細(xì)胞或組織裂解物 

1）根據(jù)檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：
 
Western Blot技術(shù)服務(wù)，WB免疫印跡，WB實(shí)驗(yàn)代測

亦可購買商業(yè)化的蛋白提取試劑盒來保證標(biāo)本制備的質(zhì)量

2）選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測的準(zhǔn)確性！

2 、蛋白定量 

常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據(jù)情況將標(biāo)本保存在-20°C /-80°C備用，進(jìn)行免疫沉淀（IP）或者直接進(jìn)行電泳分離蛋白

3 、電泳分離蛋白質(zhì) 

根據(jù)待測蛋白狀態(tài)確定電泳條件： 
 

根據(jù)待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度
 

4 、轉(zhuǎn)膜 

根據(jù)不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合適的膜類型。常用的轉(zhuǎn)移膜類型有:PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率。各種膜的技術(shù)參數(shù)及比較如下：
 

5 、封閉 

去掉膜上多余的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS

6 、一抗孵育 

一抗的選擇成功與否，是整個WB實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵：選擇一抗有以下幾個注意點(diǎn)：

選擇適合檢測標(biāo)本種屬的一抗（說明書有驗(yàn)證）

選擇適用于WB實(shí)驗(yàn)方法的一抗（說明書有驗(yàn)證）

選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化的多克隆抗體

一抗的保存和使用：

根據(jù)說明書的要求條件進(jìn)行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復(fù)凍融。

抗體的工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，在4度保存不要超過2周

根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實(shí)驗(yàn)室條件和檢測方法等的差異，說明書推薦的稀釋比例只作參考，需要在說明書推薦的濃度周邊進(jìn)行多個濃度梯度的實(shí)驗(yàn)檢測，然后選擇信噪比的抗體濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果說明書沒有推薦濃度，可進(jìn)行多個稀釋比例進(jìn)行摸索一般稀釋度（1:100-1:3000）。

孵育條件：推薦4°C孵育過夜（一般大于18個小時），根據(jù)抗體親和力不同孵育時間有所區(qū)別

內(nèi)參的選擇和使用：WB 過程監(jiān)測以及目的蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)！ 

WB常用內(nèi)參及其技術(shù)參數(shù)：
 

詳情請參考

7 、二抗孵育 

根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有推薦濃度，可進(jìn)行多個稀釋比例進(jìn)行摸索一般稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時

8 、底物孵育 

選擇顯色或者化學(xué)發(fā)光底物。一般傾向于化學(xué)發(fā)光，靈敏度高且背景低，節(jié)省抗體用量

9 、結(jié)果分析和檢測 

凝膠成像系統(tǒng)檢測或者暗室曝光到膠片